キメラRNAの検出

NGSでキメラRNAの検出に挑戦した論文

Kannal et al. Recurrent chimeric RNAs enriched in human prostate cancer identified by deep sequencing　PubMed

Q:　Chimeric RNAって、Fusion Geneのことでしょうか？

A:　もっと広い概念です。　Chimeric RNAのうち、Chromosomal Rearrangementsによって作られる複合遺伝子のことを、Fusion Geneと定義するそうです。

染色体リアレンジメント以外の原因で、転写が原因で作られるキメリックな転写産物のことも、Chimeric RNAと呼ぶそうです。

転写が原因で起こる？　

• 隣の下流遺伝子まで、転写されてしまうことで作られる、Read-through/splicing 型Chimeric RNA
• 転写された異なるRNA分子が同時にスプライシングされて、ひとつのRNA分子になる、Transsplicing 型Chimeric RNA

このような種類のChimeric RNAがあるそうです。
そのうち、前立腺癌に特徴的なキメラRNAを見つけよう！という論文です。

NGSはスクリーニングに使う、というスタンスです。
いくつもフィルタリングを重ねて、キメラRNAの候補を絞り込んでいます。

イルミナGAIIの36bpペアエンドリードを使っています。

  

1. クオリティフィルター：　リード単位でクオリティが悪いもの（イルミナパイプラインのデフォルト）を除きます
2. ユニークネスフィルター：　リードマッピングの後、マッパブルなペアエンドリードのうち、ペアとして、ゲノムまたはTranscriptに複数個所マップするものを除きます。　これによって、ペアリードの両方とも、ゲノム上またはTranscript上に1か所だけマッピングするものだけが残ります（2塩基のミスマッチはゆるしています）。　　
3. Entrez Gene IDフィルター：　ゲノムやTranscriptにユニークにヒットすると言っても、遺伝子単位でユニークかどうか。　彼らは、Entrez Gene ID単位で遺伝子を定義しています（Gene IDが無い配列は遺伝子としない）。　ペアとして複数のGene IDにマップされるリードは除かれます。　　この2と3のフィルタリングは、ユニークマッピングするペアリードだけを残すので、Gene Family（Homolog）などを間違ってキメラRNA候補としてしまうのを避けることができます。　しかし、逆に、Homologのどれかがキメラっている場合のRNAは検出できません。 実際、CLC Genomics Workbench でも経験があるのですが、Fusion Geneを検出してもHomologにばかりヒットして、擬陽性ばかりということがありました。　ユニークヒットに限ることは良いかもしれません。
4. Gene ID キメラフィルター：　キメラRNAを見つけるのが目的なので、同じ遺伝子上にペアの両方ともマップされているリードは除きます。　異なる遺伝子をまたいでマップされているリードだけに絞っています。　　イメージでは、こんな感じ（Fusion Geneと書いていますがキメラRNAと置き換えてください） 

ペアの片方が、偶然GeneAとGeneBの結合部位（ジャンクション）に合った場合、片方のペアの6塩基が完全ヒットであれば、ジャンクションにヒットしたと、見なしていました。
個人的にはもう少し長い塩基の条件にした方が良いのでは、と。

彼らは、少なくとも3本のペアリードが、同じキメラRNAの相手にマップされていた、という条件で、 6,163ものキメラ候補を3人の患者サンプルから得ました。
そのうち、後に検証しにくいKLK2またはKLK3を含むキメラを除くと、2,369にまで減りました。
20人の患者中10人に共通していたキメラは46と、ウェットで検証可能な数になりました。


世の中には、TopHat Fusionというツールがありますが、この論文では使われていないようです。